Бактериофаги, или просто фаги, являются одними из самых успешных и распространённых патогенов на планете. Эти вирусы, поражающие бактерии, присутствуют в колоссальных количествах — их число достигает астрономической величины в 10 в 31 степени. Каждый раз, когда фаг заражает бактерию, он использует выгоду клетки-хозяина для производства сотен новых вирусных частиц, которые затем выходят из бактерии в результате разрушения её мембраны — процесса, называемого лизисом. Несмотря на то, что бактериофаги были открыты ещё в 1917 году и первые их изображения получены в 1939, полное понимание механизмов их заражения и лизиса бактерий пришло лишь к началу XXI века. Ключевую роль в процессе разрушения клетки играют белки холины и эндолизины.
Холины создают отверстия в клеточной мембране бактерии, а эндолизины разрушают жёсткую клеточную стенку из пептидогликана. Через эти отверстия новые вирусные частицы покидают бактерию. Однако до недавнего времени оставался большой вопрос: как фаги регулируют точное время лизиса, чтобы максимизировать своё потомство? Существуют две противоположные стратегии, которые могли бы объяснить тайминг выхода фагов из бактерии. С одной стороны, фаги могут прерывать жизненный цикл клетки как можно раньше, чтобы дать их потомству фору для заражения новых бактериальных клеток. Такая стратегия выгодна при обилии бактерий вокруг — ранний выход увеличивает шансы распространения вирусов.
С другой же стороны, полезнее для фага оставаться внутри клетки дольше, производя больше копий самого себя. Такая стратегия становится оптимальной при дефиците бактериальных хозяев, поскольку увеличивает вероятность хотя бы одного успешного заражения в будущем. Исследования 1970-х годов дали первую подсказку, что фаги могут отслеживать потенциал мембраны бактерии — разницу электрических зарядов по обе стороны клеточной мембраны, используемую для производства энергии в виде АТФ. Когда бактерии обрабатывали цианидом, нарушающим мембранный потенциал, лизис фагов наступал раньше. Это дало понять, что мембранный потенциал связан с активацией холинов, запускающих лизис.
Значит, фаги, по-видимому, «чувствуют» энергетический статус клетки, чтобы определить, когда лучше её разрушить. Оставался неясным важный момент: мембранный потенциал исчезает постепенно в течение заражения или коллапсирует резко и внезапно непосредственно перед лизисом? Если потенциал падает постепенно, то у фага могут возникнуть проблемы, так как недостаток энергии тормозит процессы, связанные с размножением вируса, такие как репликация ДНК и упаковка генома в капсид. Это делает процесс лизиса непредсказуемым и рискованным. Если же потенциал сохраняется стабильным до последнего и резко падает в момент лизиса — фаги выигрывают время для максимального производства потомства. Точная проверка этого предположения могла стать проблемой до тех пор, пока группа биофизиков из Техасского университета во главе с Раем Янгом не провела инновационный эксперимент, в котором бактерии буквально заставили вращаться.
Особенность эксперимента заключалась в использовании бактерии Escherichia coli, у которой на одном конце есть жгутик, или флагеллум. Этот жгутик действует как пропеллер, вращаясь под действием мембранного потенциала. Чем выше потенциал, тем быстрее вращается жгутик. Вместо того чтобы наблюдать за самим слишком маленьким флагеллумом, учёные закрепили жгутик бактерии с помощью антител к стеклянной поверхности. Так, когда жгутик вращался, сама бактерия начинала вращаться в противоположную сторону.
Под обычным световым микроскопом видны вращающиеся бактерии, которые становятся индикаторами мембранного потенциала — чем быстрее они вращаются, тем выше электрический заряд на мембране. Чтобы избежать случайных колебаний начала заражения, фаги в эксперименте не использовались. Вместо этого бактерии были генетически модифицированы с плазмидой, содержащей гены холинов и эндолизинов под контролем сахарозависимого промотора. Это позволяло синхронно запускать производство этих белков во всех клетках одновременно при добавлении сахара. В ходе эксперимента бактерии вращались, пока учёные наблюдали за ними под микроскопом и после добавления сахара засекали время до лизиса.
Среднее время разрушения клетки составило около часа, с чрезвычайно маленьким разбросом в пределах нескольких минут, что свидетельствовало о точной синхронизации лизиса. Важнейшим открытием стало то, что скорость вращения бактерий не снижалась перед лизисом. Показатель мембранного потенциала оставался почти стабильным до внезапного резкого падения, после которого бактерия быстро лизировалась. Это означало, что фаги сохраняют энергетический уровень хозяина до крайнего момента, и не допускают преждевременного падения потенциала, что могло бы помешать эффективному размножению вирусов. Дальнейшие эксперименты показали, что холины активируются, когда мембранный потенциал уменьшается примерно на половину.
Для этого использовали химикат динитрофенол, снижающий мембранный заряд. При постепенном увеличении дозы динитрофенола время лизиса сокращалось, и на половине исходной скорости вращения происходил немедленный лизис, то есть активация холинов. Сама чувствительность холинов к мембранному потенциалу, как предположили учёные, является эволюционным механизмом предосторожности. В естественной среде бактерии часто заражаются не одним, а несколькими типами фагов, которые конкурируют за ресурсы внутри клетки. Если вторичный фаг вторгается в уже заражённую бактерию, он временно нарушает мембранный потенциал при вводе собственной ДНК.
Это приводит к преждевременной активации холинов и лизису, что ограничивает развитие конкурирующего фага. Таким образом, первый фаг жертвует будущим потомством ради уничтожения соперника. После опубликования этой работы в 2001 году технологии структурного анализа холинов значительно продвинулись. С помощью криоэлектронной микроскопии удалось выявить, что холины образуют кольцеобразные каналы в мембране с диаметром порядка 9 нанометров, достаточные для прохождения эндолизинов. Более того, установлено, что холины создают несколько больших отверстий, достигающих сотен нанометров, позволяющих целым фагам покидать клетку без препятствий.
В современных исследованиях вместо подхода с вращением бактерий применяются новые инструменты, например, флуоресцентные белки, меняющие цвет в зависимости от мембранного потенциала. Однако простота эксперимента Техасской группы и её гениальность показывают, насколько инновационные подходы позволяют раскрыть фундаментальные биологические механизмы даже с базовым оборудованием. Исследования, проводимые с применением вращающихся бактерий, существенно углубили понимание тонкой координации между вирусом и его хозяином. Они продемонстрировали, что время разрушения клетки вычисляется вирусом с удивительной точностью, позволяя максимизировать количество новых вирусных частиц и обеспечить успешное распространение инфекции. Таким образом, изучение взаимодействия бактериофагов с мембранным потенциалом бактерий не только проливает свет на микробиологические процессы, но и расширяет горизонты возможностей для разработки новых методов борьбы с бактериальными инфекциями, например, в области фаговой терапии.
Способность вирусов тонко «читать» энергетический статус клетки подчёркивает сложность и совершенство микроскопических биологических систем, в которых жизнь и энергия тесно переплетены.
