Метаболическая инженерия уже три десятилетия является ключевым направлением в развитии промышленной биотехнологии, предоставляя возможности создания микроорганизмов с запрограммированными функциями для производства ценных веществ. Однако рациональное проектирование штаммов с высокими показателями остается серьезным вызовом, учитывая сложность клеточных регуляторных сетей и ограниченные возможности предсказания влияния генетических изменений на желаемый фенотип. В последние годы дрожжеподобный микроорганизм Yarrowia lipolytica стал одним из наиболее перспективных хозяев для биосинтеза разнообразных химических веществ, включая липиды, жирные кислоты, пигменты и биоактивные соединения. Благодаря своей метаболической пластичности, возможности использовать широкий спектр субстратов и относительной устойчивости к разнообразным условиям ферментации, Y. lipolytica завоевала значительное внимание как объект метаболической модификации.
Ключевой проблемой при работе с Y. lipolytica, как и с другими дрожжами, является управление уровнем экспрессии генов, особенно транскрипционных факторов, которые определяют целые каскады регуляторных взаимодействий и метаболические пути. Традиционные методы повышения или подавления активности отдельных генов зачастую дают ограниченный эффект, а комплексные изменения требуют дорогих и трудоемких экспериментов. Современный прогресс в области генного редактирования открывает новые горизонты для метаболической инженерии Y. lipolytica.
Особое место занимает метод TUNEYALI — система на основе CRISPR/Cas9, которая позволяет оперативно и в высоком масштабе менять уровни экспрессии определенного набора генов путем замены их промоторов на варианты с разной силой экспрессии или полным удалением промотора. Такой подход, построенный на безследной замене промоторов, имеет массу преимуществ, включая стабильность внесенных изменений, возможность тонкой регуляции и масштабируемость для работы с сотнями генов одновременно. Разработка данной технологии была результатом детальной оптимизации параметров генного редактирования в Y. lipolytica. Исследование подтвердило, что длина гомологичных участков (homology arms) напрямую влияет на эффективность гомологичной рекомбинации: оптимальными оказались сегменты длиной порядка 162 нуклеотидов, обеспечивающие высокий выход редактированных клеток.
Применение этой методики позволило создать библиотеку из 56 транскрипционных факторов, для каждого из которых было предусмотрено семь вариантов промоторов, варьирующих силу инициирования транскрипции. Таким образом, общая сложность библиотеки составила 392 варианта, что обеспечило глубокое исследование влияния модуляции транскрипционных факторов на различные фенотипы микроорганизмов. Практическая применимость TUNEYALI продемонстрирована в нескольких ключевых сферах. Во-первых, исследование морфологических изменений показало, что замена промоторов некоторых транскрипционных факторов способствует подавлению нежелательной псевдогифовальной формы роста, которая часто вызывает проблемы при масштабных ферментациях из-за пенообразования и ухудшения кислородного обмена. При этом были выявлены новые гены-регуляторы, ранее не связанный с морфогенезом Y.
lipolytica, что свидетельствует об уникальности и расширенной функциональности разработанного инструмента. Во-вторых, технология была успешно применена для улучшения термоустойчивости штаммов Y. lipolytica. В условиях повышенной температуры трансформанты с изменённой регуляцией ряда транскрипционных факторов проявили значительное улучшение роста и жизнеспособности по сравнению с родительским штаммом. Это открывает возможности для более стабильной работы биореакторов при оптимальных производственных температурах, снижая расходы на охлаждение и поддержание параметров процесса.
Особенно ярким примером потенциала метода стала оптимизация продукции бетанина — природного красителя с широким спектром применения в пищевой и косметической промышленности. Используя TUNEYALI для настройки экспрессии транскрипционных факторов, исследователи смогли повысить титр бетанина на 24% по сравнению с исходным штаммом. При этом изменились уровни экспрессии регуляторов, влияющих на доступность кислорода, стрессовых ответ и транскрипционную активность, что косвенно улучшало производительность синтезирующих ферментов. Эта стратегия демонстрирует возможность эффективной настройки сложных метаболических цепочек через тонкую регуляцию уровней ключевых транскрипционных факторов. Несмотря на значительные успехи, технология TUNEYALI имеет свои ограничения.
Главным из них является внесение однойedитированного варианта на клон, что затрудняет одновременную модификацию нескольких генов в одном объекте и требует проведения нескольких циклов трансформаций и скринингов. Также метод не предусматривает введение новых генов, а лишь изменение уровней существующих посредством замены промоторов. Для комплексного инженерного подхода целесообразно комбинировать TUNEYALI с другими инструментами, такими как EXPRESSYALI, позволяющий вставлять несколько кассет экспрессии гомологичным образом. В целом, разработанная методология открывает перспективы для ускоренного и системного проектирования промышленных штаммов Y. lipolytica.
Возможность создавать масштабные библиотеки модифицированных вариантов и эффективно их скринировать существенно снижает затраты времени и ресурсов на поиск оптимальных решений. При этом технологии нацеленного изменения экспрессии генов обеспечивают более глубокое понимание роли регуляторных компонентов, позволяя выявлять неожиданные генетические мишени для метаболической и ферментационной оптимизации. Ключевое преимущество TUNEYALI — ее универсальность и адаптируемость. Систему можно направлять не только на транскрипционные факторы, но и на любые группы генов, что позволяет применять её в самых разнообразных биотехнологических задачах. В сочетании с современными методами высокопроизводительного скрининга, включая FACS, пластинный анализ и масс-спектрометрию, данная платформа может в значительной степени ускорить цикл разработки промышленных штаммов с высокими коммерческими показателями.
В перспективе функционалы TUNEYALI могут быть расширены для охвата полного генома Y. lipolytica, что превратит этот организм в универсальный объект для фундаментального и прикладного биотехнологического исследования. Такой подход не только улучшит метаболическую производительность, но и позволит получить ценнейшие знания о взаимодействии регуляторных сетей, адаптации к стрессам и ресурсному обмену в дрожжах. Развитие данной технологии свидетельствует о стремительном прогрессе в области системной биологии и генного редактирования. Yarrowia lipolytica, будучи нетрадиционным дрожжевым организмом, уверенно занимает место одного из лидеров среди промышленных микроорганизмов, открывая новые горизонты для устойчивого и экономически выгодного получения биохимически ценных продуктов.
Настройка экспрессии генов через продвинутые методики CRISPR/Cas9 придаёт метаболической инженерии рациональность и масштабируемость, отвечая огромным требованиям современного биопроизводства.
